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CARATTERIZZAZIONE BIOMOLECOLE

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Caratterizzazione di Biomolecole

Il laboratorio di Caratterizzazione di biomolecole del CNOS ha a disposizione una serie di strumenti che offrono la possibilità di mettere a punto la caratterizzazione completa di diverse biomolecole sia dal punto di vista strutturale che di interazione con altre molecole. Il laboratorio offre metodi label-free di ultima generazione basati sulla Risonanza Plasmonica di Supeficie (SPR) capaci di analizzare interazioni biomolecolari fornendo e risultati sull’affinità e la cinetica di legame di proteine, peptidi, DNA, RNA, aptameri, piccole molecole e altri campioni provenienti dall’industria farmaceutica, biotecnologica e diagnostica. Inoltre, il laboratorio è dotato di strumenti in grado di determinare la carica superficiale, la dimensione e la distribuzione del raggio idrodinamico di piccole particelle in sospensione o polimeri in soluzione. E ‘altresì dotato di metodiche di rilevamento di assorbanza, citometria basata su immagini, fluorescenza risolta nel tempo (TRF), luminescenza e alfa fluorescenza.
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Gli strumenti

Il Biacore ™ 8K è un sistema ad alta sensibilità basato su misurazioni di risonanza plasmonica di superficie (SPR) per lo studio di interazione tra biomolecole. Biacore™ 8K supporta l’esecuzione e la valutazione di analisi di interazione label-free, la cui risposta è direttamente proporzionale alla variazione della concentrazione di massa vicino alla superficie. Biacore ™8k è in grado di eseguire uno screening ad alto rendimento, dispone di una microfluidica composta da 8 canali separati, ciascuno dei quali costituito da due celle di flusso, al fine di fornire rapidamente dati cinetici e di affinità di alta qualità.

Biacore ™8K consente di eseguire le seguenti analisi:

 

  • Screening di frammenti e piccole molecole;
  • Screening degli anticorpi: specificità, caratteristiche di legame e livello di espressione;
  • Studio della cinetica e dell’affinità, utili in tutte le aree della ricerca e dello sviluppo biologico, compreso lo sviluppo di farmaci;
  • Determinazione di concentrazioni biologicamente rilevanti in soluzione, misura fondamentale in molti campi della ricerca sia accademica che industriale ed importante come strumento per il controllo di qualità nello sviluppo e nella produzione farmaceutica;
  • Saggi immunologici di classificazione degli epitopi;
  • Microfluidica: 8 canali separati, 2 celle di flusso ciascuno; volume della cella di flusso: 40 nL; volume di iniezione: 1-200 ul; intervallo di flusso: 1-100 ul/min; volume del campione richiesto: 20-50 ul.
  • Intervallo di indice di rifrazione: da 1,33 a 1,39
  • Temperatura di analisi: da 4 a 40 °C
  • Gestione dei liquidi: aspirazione del campione direttamente dalla piastra alle celle di flusso; 2 pompe a siringa per canale (una dosatrice, una di flusso); 3 pompe peristaltiche con filtro per il blocco di rifornimento di liquidi; buffer selector (possono essere utilizzati fino a 4 buffer differenti)
  • Autocampionatore: può contenere fino a 4 micropiastre (2 per vassoio); piastre da 96 o 384 pozzetti (standard o deep well); setti necessari se si utilizza il pooling.

Il lettore di piastre Ensight della PerkinElmer è un sistema multi-modulare in grado di analizzare in modo semplice e rapido molecole che emettono o assorbono luce. Lo strumento possiede un sistema di controllo della temperatura (2-65°C), un sistema di agitazione controllata ed è inoltre dotato di un software di analisi (Kaleido) che permette l’acquisizione delle immagini e l’analisi dei dati. Lo strumento offre sette diverse modalità di analisi riportate di seguito:

  • Assorbimento (lunghezza d’onda 230-1000 nm) mediante un monocromatore quadrupolare o filtri;
  • Fluorescenza mediante un monocromatore quadrupolare (sia dall’alto che dal basso) con lunghezze d’onda di eccitazione selezionabili da 230 nm a 835 nm e di emissione da 245 nm a 850 nm;
  • Tecnologia Alpha fornisce un metodo per il rilevamento di interazioni molecolari usando un detector fotomoltiplicatore (PMT) ad altissima sensibilità;
  • Luminescenza usando un detector fotomoltiplicatore (PMT) ad altissima sensibilità con range di lunghezze d’onda da 450 fino a 645 nm con minimo background;
  • Label-free sia per saggi basati su cellule e sia per saggi biochimici misurando i cambiamenti dell’indice di rifrazione della luce che si tramutano in un cambiamento delle lunghezze d’onda derivanti dalla dinamica di ridistribuzione di massa all’interno di una cellula o da un evento di legame;
  • Time Resolved Fluorescence (TRF) analizzando l’intensità di decadimento e/o ritardo del segnale di emissione nel tempo;
  • Well Imaging Technology che funge da microscopio ottico invertito (fluorescenza) utilizzando un obiettivo da microscopio 4x, una fotocamera sCMOS a bassa interferenza, 4 diversi LED ad alta potenza permettendo l’analisi di un intero pozzetto di una piastra da 96 con una risoluzione di circa 3 μm per pixel.
  • Metodo di rilevamento: assorbanza, citometria basata su immagini, Time Resolved Fluorescence (TRF), alfa, fluorescenza
  • Caratteristiche principali: Controllo della temperatura fino a 65 ° C; lettore di codici a barre; piatto agitazione

Zetasizer ULTRA è una piattaforma di light scattering ad alta sensibilità con ottica NIBS™, correlazione adattiva e tecnologia MADLS. Il sistema è adatto per la misura di dimensione, potenziale zeta e concentrazione di particelle in dispersione e molecole in soluzione per applicazioni in ambito farmaceutico, alimentare, biochimico e di caratterizzazione di nanomateriali.

Misure di Particle Size (DLS – Dynamic Light Scattering)
  • Angoli di misura: 12,8°, 90° e 173° (Tecnologia NIBS – Non Invasive Back Scattering)
  • Tecnologia Adaptive Correlation: misure fino a 3 volte più veloci e dati più robusti e ripetibili
  • Tecnologia MADLS – Multi Angle Dynamic Light Scattering per una maggiore risoluzione dimensionale
  • Campo di misura: 0.3 nm – 10 μm*
  • Campo di concentrazione: da 0.1 mg/mL di proteina MW 15 KDa a 40% w/v*.
  • Volume minimo di campione: 12 μL *campione dipendente
Misure di Potenziale Zeta (ELS – Electrophoretic Light Scattering)
  • Tecnica M3-PALS con Constant Corrent Mode
  • Campo di misura: nessuna limitazione
  • Conduttività massima del campione: 260 mS/cm
  • Volume minimo di campioni richiesto: 20 μL (con il metodo Barrier method), 150 μL (high concentration/precision cell – opzionale), 750 μL (dip cell).
Misure di Concentrazione
  • Range di concentrazione: 1 x 108 – 1 x1012 particelle/mL
Misure automatizzate 
  • Trend cinetico
  • Trend termico
Specifiche generali:
  • Campo di temperatura: 0 – 120 °C con effetto Peltier
  • Sorgente laser: 10 mW He/Ne 633 nm
  • Filtro per fluorescenza e DLS depolarizzata (filtri di polarizzazione orizzontale e verticale)
  • Detector APD (Avalance Photodiode Detector) ad alta sensibilità